Dull ymchwil genetig moleciwlaidd

I archwilio a nodi amrywiadau yn y strwythur DNA dull genetig moleciwlaidd a ddefnyddiwyd. Ar gyfer pob rhanbarth DNA, sy'n archwilio y rhanbarth hwn o'r cromosom, genyn neu alel, y dulliau yn wahanol. Yn sail pob dull genetig moleciwlaidd yn cynnwys rhai neu drin eraill ar RNA a DNA. Mae'r holl dulliau hyn yn cael eu nodweddu gan gymhlethdod enfawr, heb na all amodau labordy yn cael ei wneud, a rhaid i'r staff fod yn chymwysterau uchel. Mae'r gwaith hwn yn cael ei wneud mewn sawl cam.

cyfnodau

Yn gyntaf, RNA neu DNA samplau i gael ei gynhyrchu. Yma, gall dull genetig moleciwlaidd cael eu cymhwyso i bron unrhyw ddeunydd: diferyn o waed, leukocytes, fibroblasts diwylliant, mwcosa (crafu), hyd yn oed y ffoliglau gwallt, - DNA ar gael o unrhyw sampl. Mae'n addas i ddefnyddio unrhyw ddulliau genetig moleciwlaidd a'u gwahanol opsiynau ac wedi DNA ynysig hir yn cael ei storio rhewi. Yr ail gam yn ymroddedig i gronni y darnau a ddymunir (ymhelaethu) o DNA, gan ei fod yn helpu i sicrhau bod y adwaith cadwyn polymeras in vitro (in vitro heb gynnwys organeb byw). O ganlyniad, mae'r dewis lluosi darn DNA gan adwaith cadwyn hwn, a faint o gynnydd DNA llythrennol filiynau o weithiau.

Y trydydd cam yn y dulliau ymchwil genetig moleciwlaidd Tybir cyfyngiad luosi DNA (darnio hwn, rhwygo neu dorri). Cyfyngiad pherfformio gan electrofforesis ar polyacrylamide neu gel agarose. Mae'r dull moleciwlaidd-genetig astudio'r darn DNA yn galluogi pawb i gymryd swydd penodol yn y gel. Wedi hynny, mae'r gel yn cael ei drin gyda bromid ethidium, sy'n gallu rhwymo i DNA, yr arbelydru gyda golau uwchfioled, yna mae'n bosibl arsylwi dogn ymoleuedd. Dulliau diagnostig genetig moleciwlaidd yn amrywiol ac yn niferus, ond mae'r ddau gam cyntaf yn gyffredin i bawb. Ond er mwyn nodi darnau DNA, gall y gel yn cael ei liwio, a llawer o ddulliau eraill sydd eisoes yn bodoli.

rhywogaethau

Efallai y bydd y dulliau mwyaf uniongyrchol ac eang ar gyfer canfod mycobacteria yn cynnwys y dull dysgu DNA genetig moleciwlaidd uchod. Ei hanfod yw bod, er mwyn adnabod y deunydd gadwyn sgan o ddarnau penodol o DNA pathogenau. Nid yw technegau diagnostig genetig moleciwlaidd eto oes ganddynt ffordd fwy effeithlon i adnabod clefydau fel twbercwlosis. Gan ddefnyddio'r adwaith cadwyn polymeras (PCR), gallwch fod yn sicr y bydd y DNA gwreiddiol cynyddu'r nifer o gopïau mewn miliwn o weithiau, hynny yw, bydd mwyhau, a bydd yn arddangos y canlyniadau. Mae lefel sensitifrwydd yn uchel iawn - yn fwy na naw deg pump y cant, sef y prif fantais y dull hwn.

Mae gweddill y dulliau moleciwlaidd-genetig o waith ymchwil ar effeithiolrwydd cynnyrch copïau lluosog dyblu llythrennol, gan fod yn yr achos hwn y sampl drafftio yn dangos dilyniant oligonucleotide benodol gynyddu at gant a chwe gwaith. Mae hyd yn oed y diagnosis diwylliant twbercwlosis y system resbiradol ostwng ei sensitifrwydd yn sylweddol. Dyma pam meddygaeth fodern yn seiliedig ar ddulliau genetig moleciwlaidd o ddiagnosis o twbercwlosis. Mae dull a ddisgrifir yn effeithiol yn enwedig wrth ddelio â phathogenau o amrywioldeb antigenig uchel, penderfynu bod ffordd arall yn llawer mwy anodd - mae angen arbennig cyfryngau maetholion ac yn meithrin amser hir. dulliau genetig biocemegol a moleciwlaidd yn cynhyrchu effaith wahanol iawn ar y canlyniadau.

diagnosis o dwbercwlosis

Marshall PCR diagnosis o dwbercwlosis yn fwyaf cyffredin gan ddefnyddio dilyniannau DNA y rhai sy'n benodol ar gyfer pob pedwar math o'r clefyd. Er mwyn cyrraedd y nod hwn yn aml yn defnyddio preimio sy'n canfod dilyniant YW elfennau (IS-986, IS-6110), fel yr elfennau hyn nodweddu rhywogaethau mudol hynod Mycobacterium tuberculosis a bob amser yn bresennol sawl copi yn y genom. Hefyd, gall echdynnu DNA yn cael ei wneud o ddiwylliannau pur a Glinigol (sputum cleifion) drwy unrhyw ddull addas arall. Er enghraifft, mae dull Boom lle mae'r byffer lysis yn cael ei ddefnyddio ar sail y thiocyanate guanidine a silica fel y DNA cludwr. Mae nifer y cleifion sy'n wahanol bacteriolegol gwael yn cynyddu bob blwyddyn, ac felly mewn ymarfer clinigol wedi sefydlu lefel hollol wahanol o sefydliad: dull moleciwlaidd-genetig o astudio DNA wedi bod yn chwarae rhan bwysig yn y diagnosis.

Fodd bynnag, mae'n rhaid i ni gyfaddef nad yw'n heb anfanteision. Mae'r dull PCR yw defnyddio yn aml yn dod â nifer fawr o ganlyniadau ffug-gadarnhaol, ac mae'r rheswm yw nid gwallau technegol yn unig, ond hefyd y nodweddion y dull ei hun. Yn ogystal â hyn, gan ddefnyddio'r dull hwn o diagnosis i benderfynu ar y hyfywedd mycobacteria, sydd wedi cael eu nodi, ei fod yn syml amhosibl. Ond nid yw anfantais hon yw'r pwysicaf. dulliau genetig moleciwlaidd diagnosteg PCR golygu y risg o halogiad o DNA mycobacterial. gofynion ardystio ar gyfer y rheswm hwn ar gyfer labordai PCR a gynlluniwyd yn benodol galed, maent yn gofyn tri adeilad ar wahân. technoleg PCR yn fodern ac yn gymhleth iawn, mae'n ei gwneud yn ofynnol y defnydd o offer priodol a phersonél uwch-hyfforddedig.

bacterioscopy

Pryd y mae'n rhaid canlyniadau'r diagnosis y dadansoddiad yn cael ei gymharu â data arall: archwiliad clinigol, radiograffeg, microsgopeg ceg y groth, cnydau a hyd yn oed ymateb i driniaeth benodol yn bwysig iawn. Yn y gyfres, mae'r astudiaethau PCR yn unig yn un o'r cydrannau. Canfod y pathogen yn y diagnosis cynnar yn gallu bod dulliau symlaf a chyflymaf - bacteriolegol.

Mae yn cael ei ddefnyddio microsgop golau (lliwio Ziehl-Neelsen) a fflwroleuol (fluorochromes lliwio). Y fantais yw cyflymder ceg y canlyniadau. Ond mae ei anfantais yn cael ei ystyried yn iawn y gallu cyfyngedig oherwydd sensitifrwydd isel. Fodd bynnag, mae'r dull hwn yn cael ei roi argymhelliad WHO fod y mwyaf economaidd a'r ddaear i ganfod cleifion twbercwlosis. Canfod mycobacteria dull bacteriolegol werth rhagfynegi ac amcangyfrif ysgarthiad feintiol bacteriol. Llawer mwy hyderus i ddelio ag ef dulliau ymchwil genetig moleciwlaidd o dwbercwlosis.

diwylliannau

Gwell canfod mycobacteria yn adnabod astudiaethau diwylliannol. Hau deunydd patholegol mae'n cael ei wneud i mewn i'r cyfrwng wy: Mordovsky, Finn II, LJ, ac yn y blaen. Meincnodau o wrthwynebiad o mycobacteria i feddyginiaethau a thystiolaeth anuniongyrchol o effeithiolrwydd nifer o mycobacteria a'u nythfeydd in vitro, os y dull cymhwyso o ddiwylliant ymchwil. Cynyddu canran y ynysu mycobacteria brechiad o ddeunydd patholegol yn cael ei gynnal ar amgylcheddau lluosog.

Diwallu anghenion niferus diwylliannol, pathogen gynnwys grant a hylifau. A ddefnyddir yn y system hon a thwf VANTES math mesuryddion awtomatig. Rhaid Cnydau cael ei gynnal yn deori am hyd at saith i wyth wythnos. Erbyn y cyfnod hwn gall y cnwd gyda diffyg twf yn cael ei ystyried yn negyddol. Y ffordd fwyaf effeithiol o ganfod Mycobacterium tuberculosis ystyried samplau biolegol: moch cwta deunydd heintio diagnostig, sy'n hynod o agored i TB.

Mae rhai ffigurau

maes diddorol o astudiaeth, a agorwyd gan diagnosteg PCR oedd astudio'r M. tuberculosis - haint cudd. Mae'r cysyniad modern o haint TB yn awgrymu bod allan o gant o bobl a oedd mewn cysylltiad â M. tuberculosis, naw deg-mae'n ddigon cael eu heintio, ond dim ond deg ohonynt yn glefyd actif yn cael ei ddatblygu. Mae eraill yn cael imiwnedd TB, ac oherwydd naw deg y cant o'r achosion yr haint yn parhau i fod cudd. Canfod patrwm mae wedi helpu dull genetig moleciwlaidd.

Genetegwyr dweud bod pum deg pump y cant o'r rhai y mae eu cnydau patholegol deunydd yn negyddol, ac wyth deg y cant o bobl sydd wedi'u heintio â M. twbercwlosis, ond llifo heb unrhyw arwyddion o glefyd radiograffig, PCR ymatebion cadarnhaol a dderbyniwyd. Mae'n ddull diagnostig genetig helpu i nodi cleifion sydd mewn perygl gan astudiaethau PCR, gyda chanlyniadau eu dadansoddiadau (microsgopeg a diwylliant) eu negyddol, a haint is-glinigol M. tuberculosis yn bresennol.

ymchwil modern

Y Ffederasiwn Rwsia a labordai bacteriolegol yn defnyddio dull carlam o grynodiadau absoliwt: gweithgaredd reductase nitrad o mycobacteria profi gan Griess adweithydd. canolfannau gwrth-TB yn defnyddio dull sy'n caniatáu i benderfynu ymwrthedd i gyffuriau. Mae hyn yn hadu yn y cyfryngau hylif, lle awtomataidd twf radiometrig a system gyfrifo fflwroleuol o mycobacteria. dadansoddiad o'r fath yn cael ei wneud yn gyflym - hyd at bythefnos.

Ar hyn o bryd, dulliau newydd yn cael eu datblygu: ymwrthedd i gyffuriau o mycobacteria yn cael ei fesur ar lefel genoteip. Astudiaeth o'r mecanweithiau moleciwlaidd genynnau gwrthiant a dangos presenoldeb mewn mycobacteria. Mae'r genynnau yn gysylltiedig ag ymwrthedd i rai cyffuriau. Er enghraifft, genynnau Kasa, inhA, katG gwrthsefyll isoniazid, genyn rpoB - genynnau RNA 16Sp rifampicin a rpsL - streptomycin, emb1 - i ethambutol, gyrA - yn fluoroquinolone ac yn y blaen.

treigladau

Mae'r diagnosis modern cynyddu'n sylweddol y dull lefel moleciwlaidd-genetig ar gyfer astudio DNA ac yn caniatáu i gynnal astudiaethau ar raddfa fawr o treigladau yn eu holl sbectrwm. Nawr rydym yn gwybod bod y treigladau mwyaf cyffredin yn y 516, 526 a 531 codonau y genyn rpoB, ac yn nodi'r gwrthwynebiad i wahanol gyffuriau. Mae amrywiaeth eang o ddulliau ar gyfer teipio mycobacteria gan ddefnyddio, nid yn unig dulliau traddodiadol - biocemegol, biolegol a diwylliannol, ond mae hefyd yn defnyddio'n eang technegau genetig moleciwlaidd modern. Eisoes mae yn ddigonol ac yn darparu dull diagnosis cywir ar gyfer y canfod clefydau monogenic. Maent yn seiliedig ar astudiaethau DNA yn union ardal o genyn penodol. Mae hyn fel arfer yn broses gymhleth, cymryd llawer o amser ac yn ddrud, ond mae'r data a ddarperir gan ddadansoddiad genetig moleciwlaidd, yn llawer mwy cywir a llawn gwybodaeth na'r data pob dadansoddiadau eraill.

Mae wedi bod yn hysbys hir nad yw'r DNA yn newid am oes gyfan y organeb ei fod yn unrhyw gelloedd odnakova cnewyllol, ac mae hyn yn ei gwneud yn bosibl i gymryd y dadansoddiad o hollol yr holl gelloedd y corff, ar unrhyw gam o'r ontogeny. Gall y genyn difrodi yn cael eu canfod cyn ymddangosiad y symptomau cyntaf i'r clefyd clinigol ar raddfa lawn, yn ogystal ag mewn pobl heterosygaidd iach, ond mae cael mwtaniad yn y genyn. Dulliau diagnostig clefyd etifeddol genetig moleciwlaidd yn caniatáu i ddatgelu ei (dull uniongyrchol, DNA-diagnosteg), yn ogystal ag i ddadansoddi gwahanu y clefyd yn y teulu gyda loci marciwr DNA (polymorphisms genetig), sy'n cael eu cysylltu'n agos gyda genyn difrodi (hy, y dull anuniongyrchol o DNA-diagnosteg). Yn uniongyrchol neu'n anuniongyrchol - unrhyw diagnosteg DNA wedi ei seilio ar y dulliau o adnabod cyfran diffiniedig yn llym o DNA dynol.

dulliau uniongyrchol

dulliau uniongyrchol o DNA diagnosis yn pan fydd y clefyd etifeddol genyn culprit yn hysbys, fel y adnabyddus, a'r mathau o ei treigladau. Er enghraifft, mae dulliau uniongyrchol addas mewn nifer o glefydau. Mae'r corea Huntington (estyniad CTG-ailddarllediadau), ffenylcetonwria (R408W), ffibrosis systig (delF508, treigladau mawr) ac yn y blaen. Prif fantais y dull uniongyrchol yn cywirdeb diagnostig sy'n eiddo yn gyfan gwbl, ac nid oes angen i wneud dadansoddiad DNA o weddill y teulu. Os mwtaniad yn y genyn cyfatebol yn dod o hyd, mae'n caniatáu union gymeradwyo diagnosis o etifeddeg, penderfyniad genoteip ar gyfer gweddill y teulu dwyn y baich.

Mantais arall diagnosis uniongyrchol yn cael ei ystyried i nodi cludwr heterosygaidd o treigladau drwg oddi wrth berthnasau a rhieni a fu farw o'r clefyd. Mae hyn yn arbennig o wir ar gyfer afiechydon awtosomaidd enciliol. Anfanteision o ddulliau uniongyrchol hefyd ar gael. I wneud cais hwy, mae angen i chi wybod yn union leoleiddio y genyn annormal, strwythur Exon-intron o'i sbectrwm a'i treigladau. Nid yw pob clefydau monogenic heddiw wedi derbyn gwybodaeth o'r fath. Ni ellir ystyried dulliau uniongyrchol Informativeness gwblhau, oherwydd y gall un a'r un genyn yn cael nifer fawr o mwtaniad patholegol sy'n achosi datblygiad clefydau etifeddol.

dulliau anuniongyrchol

dulliau anuniongyrchol mewn diagnosteg DNA yn cael eu defnyddio o gwbl, mewn achosion eraill, os nad yw'r genyn difrodi yn cael ei nodi, ond dim ond chromosomally, neu os nad yw'r diagnosis llinell yn rhoi canlyniad (mae'n digwydd, os yw'r genyn sefydliad moleciwlaidd cymhleth neu raddau helaeth, os oes llawer treigladau patholegol). dulliau anuniongyrchol perfformio dadansoddi gwahanu o farcwyr amlffurf yn y teulu allelic. Marcwyr a geir yn yr un rhanbarth cromosomaidd neu locws Mae cysylltiad agos rhwng y clefyd ac yn cynrychioli dileadau neu mewnosodiadau, dirprwyon pwynt, ailddarllediadau, ac mae eu polymorphism oherwydd swm gwahanol o gelloedd yn y bloc.

Mae'r rhan fwyaf cyfleus ar gyfer diagnosis micro hystyried a'u minisatellite polymorphisms anuniongyrchol, sy'n cael eu dosbarthu'n eang yn y genom dynol. eu gwerth a fynegwyd yn cynnwys gwybodaeth yn uchel, os nad difrod i'r pellter genetig rhwng y marciwr a'r genyn yn rhy fawr. Yn yr achos olaf, cywirdeb amcangyfrif yn cael ei bennu i raddau helaeth amlder ailgyfuniad rhwng y marciwr amlffurf a difrod. Dulliau diagnostig anuniongyrchol hefyd yn darparu cam cychwynnol gorfodol o amleddau alel yr astudiaeth boblogaeth ddadansoddwyd ymhlith cleifion a chludwyr o treigladau, yn ogystal â'r angen i benderfynu ar y tebygolrwydd o ailgyfuniad o farcwyr nonequilibrium a adlyniad a alelau mutant.

dulliau eraill

Ni all segmentau byr o RNA neu DNA, yn ogystal â genyn unigol dychmygu dan astudiaeth microsgopig fod, felly, i nodi treigladau sydd eu hangen gan diagnosis genetig moleciwlaidd. Mae "Prosiect Genom Dynol", yn ogystal â datblygiadau eraill mewn geneteg foleciwlaidd ehangu'n sylweddol y posibilrwydd o diagnosis o glefydau etifeddol - cyn ac ar ôl geni. Gall y dulliau hyn yn darparu ganfod yn gynnar a gwneud rhagfynegiad poly- a chlefydau monogenic, y mae ei ymddangosiad cyntaf yn digwydd pan fyddant yn oedolion. Yn anffodus, oherwydd y galluoedd technegol astudiaethau genetig moleciwlaidd weithiau y tu hwnt i'r terfynau moesegol sy'n cael eu gosod mewn perthynas ag etifeddiaeth, yn enwedig pan fydd y diagnosis yn llencyndod a phlentyndod.

annormaleddau cromosomaidd strwythurol a rhifiadol yw achosion mwyaf cyffredin o glefyd a chanser, a llawer o Camffurfiadau. Mae angen i aberrations cromosomaidd gael eu nodi, sy'n bwysig ar gyfer cwnsela teulu - i asesu'r rhagolygon, ynghyd â risg atgenhedlu mewn beichiogrwydd yn y dyfodol. dadansoddiad Cromosom yw'r "safon aur" o ddiagnosis genetig, ond mae'n gyfyngedig. Dim ond y dulliau dadansoddi genetig moleciwlaidd gall wneud mwy, oherwydd bod defnyddio clonio labeli fflwroleuol seiliedig ar dechnoleg sy'n gallu eu sensitifrwydd uchel i nodi newidiadau cromosomaidd cynnil sy'n amhosibl i ganfod clasurol astudiaethau sytogenetig. Mae'r technegau hyn yn gynyddol yn ehangu ein galluoedd diagnostig, pan archwiliwyd, plant ag anableddau datblygiadol, arafwch meddwl, gyda llawer o afiechydon etifeddol eraill.

canfyddiadau

Mae'n bwysig iawn i ddynoliaeth oedd y strwythur genynnau a swyddogaeth gwybodaeth, mathau o amrywioldeb, y gallu i ganfod clefydau etifeddol a ddigwyddodd mewn cysylltiad â datblygu geneteg foleciwlaidd. ei ddulliau yn cael eu hanelu at yr astudiaeth y moleciwl DNA - a pan fydd yn normal, a pan gaiff ei ddifrodi. Paratoi dilyniannau asid diocsiriboniwclëig o niwcleotidau (DNA) yn ymestyn mewn camau o dderbyn samplau i adnabod darnau unigol. Ynysu DNA genomig o'r celloedd, cyfyngiad (rhwygo), chwyddo sain (clonio), electrofforesis o'r darnau (gwahanu eu gwefr drydanol a moleciwlaidd pwysau drwy gel agarose). Adnabod darnau penodol lleoli ar wyneb streipen arwahanol.

Yna mynd i mewn i'r ddeddf hidlwyr arbennig, drwy sy'n pasio pob hybrideiddio darn gyda darnau DNA clonio neu probes ymbelydrol synthetig yn rheoli, a fydd yn gyfartal i bob sampl prawf. Os byddwch yn newid y sefyllfa neu hyd o'i gymharu â'r chwiliedydd, os bydd darn newydd neu diflannu - mae hyn i gyd yn awgrymu bod y genyn a ddadansoddwyd wedi cael ei ailstrwythuro yn y dilyniant niwcleotid. Mae wyth o dechnegau sylfaenol o astudiaethau genetig moleciwlaidd: dilyniannu (penderfynu dilyniant DNA), adwaith cadwyn polymeras (cynnydd yn y nifer o ddilyniannau), paratoi preimio hysbys genynnau, clonio DNA, cynhyrchu moleciwlau ailgyfunol deillio proteinau oherwydd moleciwlau ailgyfunol, gan greu set gyflawn (casgliad llyfrgell) darnau a gafwyd drwy ddefnyddio cyfyngiad clonio.